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浅谈微生物农药管理的规范化

信息来源:《农药》2021年第6期 作者:王以燕1,袁善奎1,农向群2,李梅2(1.农业农村部农药检定所;2.中国农业科学院植物保护研究所) 微生物农药是以真菌、细菌、病毒或基因修饰的微生物等活体作为有效成分的农药。我国的微生物农药一直稳步发展,截至2020年12月31日,已取得登记的微生物农药有效成分有47种、产品548个,其数量分别占生物农药有效成分和产品数量的37.6%和31.6%。 2017年新修订《农药管理条例》和《农药登记资料要求》发布实施以来,国家对微生物农药的登记注册实施了多项优惠措施,并自2020年9月18日起,将微生物农药的登记审批纳入绿色通道,在保障质量和安全的前提下加快技术审查进程。另外,国家也先后实施了生物农药税收和使用补贴政策。 尽管我国较早就开展微生物农药产品登记工作,但由于对各类微生物农药特性考虑和认识不足,在命名、特征表述和技术要求方面尚存在一些不到位、欠规范等基础问题,不能适应新技术发展要求,不利于产业的健康发展。为了规范微生物农药管理,提高我国微生物农药技术水平,本文从微生物农药的名称、鉴定方法、含量单位等方面进行了探讨,并提出管理建议。1 微生物农药有效成分的命名 微生物农药的有效成分必须正确表征物种名称和特征,通常采用微生物拉丁学名和规范书写形式,尽可能使用准确或公认的中文名称,并提供适当的鉴别方法和基本要求。随着微生物分类学技术的发展和进步,还应当尽量及时采用新修订的物种名称和新改进的鉴定方法。 微生物物种名称是根据微生物分类系统的拉丁学名,植物病毒一般采用英文名。拉丁学名由国际微生物学会联合会(International Union of Microbiological Societies,简称IUMS)宣布确定,IUMS负责制定国际微生物术语词汇代码和病毒分类等。1980年中国微生物学会已加入该组织。 微生物细菌、真菌等的命名采用生物学的双名法,即由拉丁文的属名和种名组成,斜体书写或下加横线,属名的首字母大写。在有物种分化的情况下,采用三名法,即在双名基础上,再加上亚种(subsp.)、变种(var.)及血清型(serotypes)等的命名(见表1)。可附带命名人名字及命名时间,定名人用正体,首字母大写,但初定名人需加括号放在后定名人之前,最后是定名时间。如Bacillus subtilis (Ehrrnbeg)Cohn 1982,Bacillus thuringiensis subsp. israelensis strain SA-11等。表1 微生物命名的层级关系 病毒命名是采用国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)制定的《国际病毒分类与命名原则》(The International Code of Virus Classification and Nomenclature)及对病毒种名书写规则。病毒分类和命名不遵守优先法则,所用命名应便于使用和记忆,在设立新分类阶元时,不能使用人名命名,上标和下标字符、连字符、斜线、希腊字母等在新命名中不能使用;缩拼字命名可被作为分类阶元名称。新命名须有一个同时被承认的代表物种(type species),且不能与已承认的病毒名称重复;人工重组的病毒和实验室杂种病毒在分类学上不予考虑。 2020年9月16日,ICTV网站发布了 对如何书写病毒、物种和其他类群名称的建议 ,明确了微生物病毒农药名称应包括宿主属种名和特性词,属名首字母大写,其余字母小写,但组成毒株编码的可大写,全部均采用正体书写(较之前采用斜体有变化);只有在属种名用于系统分类时才用斜体表示。病毒的分类和命名在不断发展和完善。如 Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus Pieris rapae granulovirus 等。 另外,病毒的英文组合词较长,习惯使用缩拼词,主要有核型多角体病毒类 nucleopolyhedrovirus 和颗粒体病毒类 granulovirus 等。2 微生物农药名称规范管理2.1 名称规范 我国微生物农药名称采用微生物物种拉丁学名和中文通用名称(即中译文名)表示。 细菌、真菌名称采用 属名+种名+株系编码 。物种(简称 种 )是生物分类学研究的基本单元与核心。微生物农药产品名称应当有准确的属名和种名,如 棘孢木霉Trichoderma asperellum 哈茨木霉 Trichoderma harzianum 等,不能只有属名,如 木霉Trichoderma spp. 。中译名采用已经公认接受的译名,通常是依据拉丁学名的词意或译音翻译而得,如有 杆 球 弧 螺旋 等形态描述的文字,并需准确对应,避免遗漏而产生误解,如 Coniothyrium minitans 中译文名为 小盾壳霉 ,而不是 盾壳霉 ; Conidioblous thromboides 中译文名为 块耳霉 ,而不是 耳霉菌 ;在中文名中不能随意减字,如 苏云金芽孢杆菌 不能写成 苏云金杆菌 ,也不能随意加括号,根据三名法, 亚种 排列在种名后、不用加括号标注,如 苏云金芽孢杆菌以色列亚种 等。病毒名称采用 宿主名+特性词+病毒(+株系编码) 形式表示,而其中英文特性词部分习惯使用缩拼词。一般病毒名称较长,在标签、登记证及文章首次出现的名称应书写完整,用括号加注病毒缩写代码,而不能只写代码。目前为避免重复,杆状病毒缩写多采用属/种名首位单字母变成双字母和特性词+病毒的缩写词组成,如 HearNPV PlxyGV 等,但有部分传统病毒保留单字母及通用M(multiple)或S(single)名称的表示,如 AcMNPV 等。 在微生物名称中其他英文词部分,如亚种subsp.、血清型serotype、株系strain、菌株isolate等词(小写)和株系编码(大写)用正体书写。在正式文章第一次出现的微生物农药名称应书写完整,如重复出现可采用缩写形式,如 T. harzianum 等。为规范微生物农药名称,避免出现同物异名,企业在申请微生物新农药品种登记时,需提交建议名称及相关资料,由全国农药标准化技术委员会出具微生物农药的中文命名函,经全国农药评审委员会审批,报请农业农村部批准。2.2 株系编码 株系并不是按系统发育的分类,可以代表寄主、地理、地点或其他特征的差别。株系编码由企业或研究者编制,尚无特定要求,一般多以字母、数字和符号随意组合或按某种序列。 编码一般可由规律性和个性化2部分字符组合编码,以与其他株系产品区别。其设定惯例:一是可选择微生物物种学名的首字母缩写(多为首选),二是可选择地方或单位缩码;三是可选择加注菌种保藏中心编码或其尾号表示;四是可选择个性化编码,如株系特性数字等。株系编码不建议字符排序过长,尽量控制在10个字符以下,鼓励简约化表示,以便于记忆、使用和推广,有利于微生物农药的科学发展和专业管理。在编码前的 株系strain 或 菌株isolate 一词在国际文章中多数在书写微生物农药名称是完整的,但没有标注的一般也不会产生歧义。 我国早期登记的微生物农药缺少株系编码,因此不同企业登记的同一种微生物农药很难区分,有的可能遗传背景非常相似且活性差异较小,有的也可能在活性上有显著的差异,从科学角度来看,同一种微生物农药的不同株系在活性方面确实存在差异,应通过株系编码加以区分,但前提是确实是属于不同来源的同一种微生物农药。这与国际上作法也是相同的。3 鉴别方法和基本原则 微生物农药通常至少需要鉴定到种名。细菌、真菌和病毒等不同类别微生物农药的常用鉴别方法见表2。鉴别的原则首先是选择物种特异性特征,可采用形态、生理生化或分子标记等,以区别于其他物种;其次是尽量选择高效、灵敏且便捷的方法,如有异议再选择其他相对复杂、精准的方法。另外,考虑到病毒农药专一性强,可采用专性宿主的生物测定法作为 活性 鉴别的补充,例如在《病毒微生物农药苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒标准》NY/T 3279 2018中,除了选择PCR扩增、DNA测序分子鉴定外,还采用对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和家蚕3种幼虫进行生物测定毒种鉴别。表2 微生物农药常用鉴别方法 国际上,经济合作与发展组织(OECD)和欧盟(EU)等的法规要求微生物农药有效成分鉴定到种级水平上,主要依据生物分类学、形态学和生理生化特征(如传统细菌鉴定方法可使用革兰氏染色、培养和生化方法对生物体表型态鉴定),没有提出必须采用分子生物学方法,主要考虑到此方法和设备尚未普及。在FAO/WHO新修订《FAO/WHO农药标准制定和使用手册》(2018)第九章 微生物农药标准规范 (简称FAO/WHO《微生物农药标准》)中也建议采用最简单、经典、易获得并具有成本效益的方法进行鉴别,一般有一种明确的鉴别方法即可,在有异议和必要时再增加至少1项鉴别试验。4 有效成分含量及单位 《农药登记资料要求》中对一般农药制剂规定了有效成分含量的允许波动范围,由于微生物农药是活体生物,其有效成分含量单位、测定方法及精确度均不同于化学农药,因此规定微生物农药母药和制剂的有效成分含量均为 。目前虽然对上限尚无明确规定,但在FAO/WHO《微生物农药标准》明确指出,一般含量为 ,如存在风险,可规定上限,即设定最低和最高含量;在特殊情况下,可接受含量超额,但须说明理由,且超额应尽可能低。 微生物农药含量单位常见的有:孢子(spore)、毒力效价(ITU或IU)、菌落形成单位(Colony Forming Units,CFU)、包涵体(Occlusion Body,OB)或多角体(Polyhedral Inclusion Body,PIB)。目前真菌微生物农药多以孢子数量表示,也有用CFU表示的;细菌微生物农药多采用CFU表示,仅有苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌采用ITU/IU表示;病毒微生物农药通常采用OB或PIB的数量表示。目前习惯上对颗粒体的病毒用OB,多角体多用PIB或IB,但近期在国际病毒类杂志和美国病毒产品标签上不论是颗粒体还是多角体病毒都主要以OB为病毒单位。5 微生物农药规范管理建议5.1 规范有效成分名称 现有微生物农药名称中还存在一些不规范的地方,建议进行统一和规范。如细菌微生物农药有 芽孢 和 芽胞 2种表示,根据《农药中文通用名称》(GB 4839 2009)的中文名称,并遵循多数文献和出版物建议沿用 芽孢 ;据 耳霉菌 盾壳霉 的拉丁名,其中文名应为 块耳霉 小盾壳霉 ;根据近期生物分类学, 微孢子虫 已由原生动物归为真菌微孢子属,建议 蝗虫微孢子虫 改为 蝗虫微孢子 ;对于 木霉 或 木霉菌 拉丁名为属名或该属的各种菌的集合,未指定种名,现多用 木霉 不加缀 菌 字,新登记的木霉产品应明确到种,种名也无需加缀 菌 字,如哈茨木霉等;对于 寡雄腐霉 ,也无需加缀 菌 字;病毒名称为拉丁文/英文组合,按照国际病毒分类委员会的建议用正体小写、首字母大写,采用特性缩拼词,括号中为病毒缩写词。其中 黏虫颗粒体病毒 的拉丁名Pseudaletia unipuncta granulovirus,现名为Mythimna unipuncta granulovirus。另外,根据 蟑螂病毒 (俗名)的拉丁名,中文名应为 黑胸大蠊浓核病毒 ;其拉丁名 Periplaneta fuliginosa densovirus(PfDV) 已由ICTV(2013.07.19)更名为Blattodea nambidensovirus 1,蜚蠊双义浓核病毒(暂译名)。表3总结归纳了现有已登记微生物农药的中英拉文通用名称。表3 我国已登记微生物农药有效成分名单5.2 规范含量单位表述 我国微生物农药含量单位与境外的表示基本相同,但在中文表述上还需要规范。在微生物农药定义中已明确是活体生物,且不论采用平板菌落计数法测定含菌量(CFU),还是血球计数板法测定含孢量(含孢量=孢子实测数量 活孢率),都是测定的活体物质,故不建议在微生物农药有效成分含量中文单位中使用 活 字;另外,不宜使用没有专用量名词、口语化的 个 字,如 个孢子 ,或只用数量词 亿 或 亿个 表示是不完整的,必须有实质性计量单位,规范表述微生物农药含量单位。 微生物农药含量单位不是根据微生物农药名称,而是依据其可观察计数的形态特性、可定量的生化或分子特征,采用相应的测定方法来决定含量单位。由于细菌芽孢杆菌属的芽孢个体小,很难在显微镜下能直接观察计数,含量单位一般不是 芽孢 ,多采用平板菌落计数法测定(除苏云金芽孢杆菌和球形芽孢杆菌等外),有效成分 含菌量 单位明确为 CFU 。目前存在含量单位与检测方法错搭的情况,如枯草芽孢杆菌登记的产品几乎都采用行业标准中平板菌落测定含量的方法,而实际登记产品计量单位却多用 亿孢子/g 活芽孢/g 亿个/g 等表示,用 CFU 表示含量的仅占该产品登记数量的14%;又如登记的真菌木霉类产品测定方法也多采用平板菌落计数法,其中以 CFU 表示单位的仅占15.8%。微生物农药含量单位须与采用的检测方法相匹配,否则会造成疑惑和误解。 真菌微生物农药或多角体病毒一般个体略大,其形态可在光学显微镜下清楚观察和计数,故多采用血球计数板法测定含孢量或包涵体数量,单位用孢子或OB/PIB表示。颗粒体病毒和浓核病毒类农药的病毒粒子小、不易直接观察检测,在有条件下采用实时荧光定量PCR法,从获得病毒基因拷贝数即可推测颗粒体病毒包涵体数量,但颗粒体病毒往往会采用简易的细菌计数板法直接计数,单位用OB表示。5.3 混配制剂含量单位表述 对于农药混配制剂,如果有效成分的含量单位一致时,其总含量可以将各组分含量相加,对于各组分含量单位相同的微生物农药混剂可参照此方法,如 105亿CFU/g(5亿CFU/g多粘芽+100亿CFU/g枯草芽) 。但在各组分含量单位不相同时不宜相加(或不宜留白不表示或用 / 表示或 仅标明其中某组分含量 等),应分别列出各组分含量和单位,如 1千万PIB/mL(棉核)+2000 IU/ L(苏云菌) 、 30亿OB/g(黏颗)+100亿芽孢/g(苏云菌) ,实际在这2个标准中B.t.含量的测定均是毒素蛋白,其含量分别为0.2%和2%。苏云金芽孢杆菌在混剂中一般很难单独测定效价,为此建议混剂中的B.t.可采用毒素蛋白法测定,其产品含量单位也需采用与检测匹配方法正确表达。 另外,可参考FAO/WHO的《微生物农药标准》中有效成分含量以 g/kg或g/L(或适当单位)表示 和美国微生物农药产品标签上有效成分的表示方法。即在产品标签上标注有效成分(即母药)及其他组分(包括助剂等)的百分含量(m/m),并标明由微生物质量控制方法测定产品中的有效成分含量和相应单位,即每单位质量或体积的孢子数、CFU、OB/PIB、ITU等。这样对微生物农药产品含量表达相对清晰,且适用单剂和混剂的含量表示,但目前在国内登记的微生物农药产品中未见该表述方法。 规范微生物农药有效成分含量及其单位的表述,有利于用户看懂产品有效成分含量,实现精准用药,提高产品防效,也有利于普及推广微生物农药的使用和科学管理。 致谢:中国科学院武汉病毒研究所孙修炼、中国科学院动物研究所秦启联、张寰的帮助。
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